A reação em cadeia da polimerase digital de droplets (partições/gotículas) (ddPCR) é um melhoramento biotecnológico dos métodos convencionais de reação em cadeia da polimerase (PCR) que pode ser usada para quantificar e amplificar clonalmente cadeias de ácidos nucleicos, incluindo DNA, cDNA ou RNA. A principal diferença entre ddPCR e qPCR reside no método de medição das quantidades de ácidos nucleicos, sendo o primeiro um método mais preciso do que o PCR, embora também mais propenso a erros nas mãos de utilizadores inexperientes. O PCR realiza uma reação por amostra. O ddPCR também realiza uma única reação dentro de uma amostra, porém a amostra é separada em um grande número de partições e a reação é realizada em cada partição individualmente. Essa separação permite uma coleta mais confiável e uma medição mais sensível das quantidades de ácidos nucleicos. O método demonstrou ser útil para o estudo de variações em sequências genéticas, como variantes de número de cópias e mutações pontuais.

O ddPCR é um método no qual uma reação de amostra de (usualmente) 20 microlitros, incluindo primers de ensaio e sondas Taqman ou um corante intercalante, é dividida em aproximadamente 20.000 gotículas de óleo de tamanho nanolítrico por meio de uma técnica de emulsão água-óleo, termociclada até o ponto final em uma placa de PCR de 96 poços, e a amplitude de fluorescência é lida para todas as gotículas em cada poço de amostra em um citômetro de fluxo de gotas. O número de cópias de genes obtido em ensaios de ddPCR tem sido usado para estimar a intensidade da infecção de doenças. Após a amplificação, a reação é lida usando um leitor de câmera de alta potência com filtro de fluorescência (HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 e Texas Red) para todas as partições. Usando diferentes corantes fluorescentes, é possível medir até quatro genes em simultâneo.

Princípios

O método de reação em cadeia da polimerase (PCR) é usado para quantificar ácidos nucleicos por meio da amplificação de uma molécula de ácido nucleico com a enzima DNA polimerase . O PCR convencional baseia-se na teoria de que a amplificação é exponencial. Portanto, os ácidos nucleicos podem ser quantificados comparando-se o número de ciclos de amplificação e a quantidade de produto final do PCR com os de uma amostra de referência. No entanto, muitos fatores complicam esse cálculo, criando incertezas e imprecisões. Esses fatores incluem: os ciclos iniciais de amplificação podem não ser exponenciais; a amplificação por PCR eventualmente atinge um platô após um número incerto de ciclos; e baixas concentrações iniciais de moléculas de ácido nucleico alvo podem não ser amplificadas a níveis detectáveis. Contudo, a limitação mais significativa do PCR é que a eficiência da amplificação por PCR numa amostra de interesse pode ser diferente daquela das amostras de referência.

1) Misturar os componentes como se fosse um PCR regular Em vez de realizar uma reação por poço, o ddPCR envolve a partição da solução de PCR em dezenas de milhares de gotículas de tamanho nanolítrico, onde uma reação de PCR separada ocorre em cada uma delas. Uma solução de PCR é preparada de forma semelhante a um ensaio TaqMan, que consiste em DNA molde (ou RNA), sondas de supressão de fluorescência, primers e uma mistura mestra (master mix) de PCR, que contém DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e tampões de reação em concentrações ideais. 2) Criar os droplets (partições/gotículas) Vários métodos diferentes podem ser usados para particionar as amostras, incluindo placas de micropoços, capilares, emulsão de óleo e conjuntos de câmaras miniaturizadas com superfícies de ligação a ácidos nucleicos. A solução de PCR é particionada em unidades menores, cada uma com os componentes necessários para a amplificação. 3) Termociclagem - reação em cadeia como um PCR normal As unidades particionadas são então submetidas à termociclagem para que cada unidade possa sofrer amplificação por PCR independentemente. 4) Medição da fluorescência Após múltiplos ciclos de amplificação por PCR, as amostras são verificadas quanto à fluorescência com uma leitura binária de "0" ou "1". A fração de gotículas fluorescentes é registrada. O particionamento da amostra permite determinar o número de moléculas diferentes, assumindo que a população de moléculas segue a distribuição de Poisson, levando em conta a possibilidade de múltiplas moléculas-alvo habitarem uma única gotícula. Usando a lei dos pequenos números de Poisson, a distribuição da molécula-alvo dentro da amostra pode ser aproximada com precisão, permitindo a quantificação da fita-alvo no produto de PCR. Este modelo simplesmente prevê que, à medida que o número de amostras contendo pelo menos uma molécula-alvo aumenta, a probabilidade de as amostras conterem mais de uma molécula-alvo também aumenta. As vantagens do ddPCR incluem maior precisão por meio do particionamento massivo da amostra, o que garante medições confiáveis na sequência de DNA desejada devido à reprodutibilidade. As taxas de erro são maiores ao detectar pequenas diferenças de expressão com o PCR básico, enquanto as taxas de erro são menores com ddPCR devido às menores diferenças de expressão que podem ser detectadas na sequência de DNA. A própria técnica reduz o uso de um volume maior de reagente necessário, o que inevitavelmente reduzirá o custo da experiência. Além disso, o ddPCR é altamente quantitativo, pois não depende da fluorescência relativa da solução para determinar a quantidade de DNA alvo amplificado. O ddPCR pode detectar e quantificar mais espécies-alvo individuais por canal de detecção do que o qPCR, em virtude de ser capaz de distinguir alvos com base na sua amplitude de fluorescência diferencial ou pelo uso de combinações de cores distintas para sua detecção. Na mesma reaão, o ddPCR, pode detetar até 4 genes diferentes (Multiplex).

Comparação entre ddPCR e PCR em tempo real (qPCR) O ddPCR mede o número real de moléculas (DNA alvo), pois cada molécula está em uma gota, tornando-se assim uma medição "digital" discreta. Ela fornece quantificação absoluta porque o ddPCR mede a fração positiva das amostras, que é o número de gotas que fluorescem devido à amplificação adequada. Essa fração positiva indica com precisão a quantidade inicial de ácido nucleico molde. De forma semelhante, o PCR em tempo real (qPCR) utiliza fluorescência; no entanto, ele mede a intensidade da fluorescência em momentos específicos (geralmente após cada ciclo de amplificação) para determinar a quantidade relativa da molécula alvo (DNA), mas não pode especificar a quantidade exata sem construir uma curva padrão usando diferentes quantidades de um padrão definido. Ele fornece o limiar por ciclo (CT) e a diferença no CT é usada para calcular a quantidade inicial de ácido nucleico. Assim, o qPCR é uma medição analógica, que pode não ser tão precisa devido à extrapolação necessária para se obter uma medição. O ddPCR mede a quantidade de DNA após a amplificação estar completa e, em seguida, determina a fração de réplicas. Isso representa uma medição de momento final, pois requer a observação dos dados após a conclusão da experiência. Em contraste, o qPCR registra a fluorescência relativa do DNA em pontos específicos durante o processo de amplificação, o que requer interrupções no processo experimental. Esse aspecto "em tempo real" do qPCR pode, teoricamente, afetar os resultados devido à interrupção da experiência. Na prática, porém, a maioria dos termocicladores de qPCR lê a fluorescência de cada amostra muito rapidamente no final da etapa de anelamento/extensão, antes de prosseguir para a próxima etapa de fusão, o que significa que essa preocupação hipotética não é realmente relevante ou aplicável para a grande maioria dos investigadores. O ddPCR mede a amplificação medindo os produtos do ciclo de PCR no momento final e, portanto, é menos suscetível a artefatos decorrentes de eficiências de amplificação prejudicadas devido à presença de inibidores de PCR ou incompatibilidade de primers e moldes. O PCR digital em tempo real (rdPCR) combina as metodologias do PCR digital de droplets (ddPCR) e do PCR quantitativo (qPCR), integrando a precisão do ddPCR com as capacidades de análise em tempo real do qPCR. Esta integração visa proporcionar maior sensibilidade, especificidade e a capacidade de quantificação absoluta de sequências de ácidos nucleicos, contribuindo para a quantificação de material genético em pesquisas científicas e clínicas. O qPCR é incapaz de distinguir diferenças na expressão génica ou variações no número de cópias que sejam menores que duas vezes. Por outro lado, o ddPCR tem uma precisão maior e demonstrou detectar diferenças de menos de 30% na expressão génica, distinguir entre variações no número de cópias que diferem em apenas 1 cópia e identificar alelos que ocorrem em frequências menores que 0,1%.

Aplicações O PCR digital de droplets tem muitas aplicações em investigação básica, diagnósticos clínicos e testes ambientais. Os seus usos incluem a detecção de patogéneos e análise da saúde digestiva ; biópsia líquida para monitoramento de cancro, monitoramento de rejeição de transplante de órgãos e teste pré-natal não invasivo para a deteção anomalias genéticas graves; análise de variação do número de cópias, análise de expressão de gene único, detecção de sequências raras, perfil de expressão génica e análise de célula única ; a detecção de contaminantes de DNA em bioprocessamento, a validação de edições genéticas e a deteção de alterações específicas de metilação no DNA como biomarcadores de cancro, bem como a determinação do número de cópias de plasmídeos em populações bacterianas. O ddPCR também é frequentemente usado como um método ortogonal para confirmar mutações raras detectadas por sequenciamento de nova geração (NGS) e para validar bibliotecas de NGS.

Quantificação absoluta O ddPCR permite a quantificação absoluta e reprodutível de ácidos nucleicos alvo com resolução de molécula única. Comparado ao PCR quantitativo analógico (qPCR), a quantificação absoluta com ddPCR não requer uma curva padrão . O ddPCR também apresenta maior tolerância a substâncias inibidoras e ensaios de PCR que amplificam de forma ineficiente em comparação com o qPCR. Exemplos de aplicações são: Quantificação da presença de sequências específicas de organismos geneticamente modificados contaminantes em alimentos, carga viral no sangue, PBMCs, amostras de soro, tecidos de vilosidades coriônicas, biomarcadores de doenças neurodegenerativas no líquido cefalorraquidiano, e contaminação fecal na água potável.

Variação do número da cópia Uma alteração no número de cópias em relação a um lócus de referência de cópia única é denominada "variação do número de cópias " (CNV) se ocorrer em células germinativas, ou alteração do número de cópias (CNA) se ocorrer em células somáticas. Uma CNV ou CNA pode ser devida a uma deleção ou amplificação de um lócus em relação ao número de cópias do lócus de referência presentes na célula e, juntas, contribuiem de forma relevante para a variabilidade no genoma humano . Elas têm sido associadas a cancros; doenças neurológicas, psiquiátricas, e autoimunes; e reações adversas a medicamentos. No entanto, é difícil medir essas variações alélicas com alta precisão usando outros métodos, como qPCR, o que torna desafiante o estabelecimento de associações fenotípicas e com doenças relacionadas ao status alterado de CNV. O grande número de medições de momento final "digitalizadas" possibilitadas pelo particionamento da amostra permite que o ddPCR capture pequenas diferenças no número de cópias com melhor precisão e exatidão quando comparado a outros métodos, como microarrays baseados em SNP ou qPCR. O qPCR é limitade na sua capacidade de quantificar com precisão as amplificações génicas em diversas doenças, incluindo a doença de Crohn, a infecção pelo HIV-1 e a obesidade. O ddPCR foi projetado para medir a concentração de um alvo de ácido nucleico em cópias por unidade de volume da amostra. Quando se opera em reações diluídas, onde menos de ~10% das partições contêm um alvo desejado (referido como "diluição limite"), o número de cópias pode ser estimado comparando-se o número de gotículas fluorescentes provenientes de uma CNV alvo com o número de gotículas fluorescentes provenientes de um lócus de referência invariante de cópia única. De facto, tanto nessas concentrações de alvo mais baixas quanto em concentrações mais altas, onde múltiplas cópias do mesmo alvo podem co-localizar-se numa única partição, a estatística de Poisson é usada para corrigir essas ocupações múltiplas, fornecendo um valor mais preciso para a concentração de cada alvo. O PCR digital de droplets tem sido usado para descobrir a variação germinativa e somática no número de cópias de genes entre humanos e para estudar a ligação entre a amplificação de HER2 (ERBB2) e a progressão do cancro de mama .

Detecção de mutações raras e alelos raros O particionamento no PCR digital de droplets aumenta a sensibilidade e permite a detecção de eventos raros, especialmente variantes de nucleotídeo único (SNVs), isolando ou diminuindo significativamente o sinal do biomarcador alvo do ruído de fundo potencialmente competitivo. Esses eventos podem ser organizados em duas classes: detecção de mutações raras e detecção de sequências raras.

Detecção de mutações raras A detecção de mutações raras ocorre quando um biomarcador existe num contexto de uma contraparte altamente abundante que difere apenas por uma única variante de nucleotídeo (SNV). O PCR digital de droplets demonstrou ser capaz de detectar DNA mutante na presença de um excesso de 200.000 vezes de fundo do tipo selvagem, o que é 2.000 vezes mais sensível do que o alcançável com o qPCR convencional.

Detecção de sequências raras O PCR digital de droplets pode detectar sequências raras, como o DNA do HIV em pacientes com HIV e o DNA de bactérias fecais em amostras de água do oceano e de outros locais para avaliação da qualidade da água. O ddPCR pode detectar sequências tão raras quanto 1 em cada 1.250.000 células.

Biópsia líquida A capacidade do ddPCR de detectar mutações raras pode ser particularmente benéfica na clínica por meio do uso da biópsia líquida, uma estratégia geralmente não invasiva para detectar e monitorizar doenças através de fluidos corporais. Investigadores têm usado a biópsia líquida para monitorizar a carga tumoral, a resposta ao tratamento e a progressão da doença em pacientes com cancro, medindo mutações raras no DNA tumoral circulante (ctDNA) em diversos fluidos biológicos, incluindo sangue, urina e líquido cefalorraquidiano . A detecção precoce de ctDNA (como na recidiva molecular) pode levar à administração mais rápida de uma imunoterapia ou de uma terapia direcionada específica para a assinatura mutacional do paciente, potencialmente melhorando as hipóteses de eficácia do tratamento, em vez de esperar pela recidiva clínica antes de alterar o tratamento. As biópsias líquidas podem ter resultados em poucos dias, em comparação com duas a quatro semanas ou mais para testes baseados em tecido. Esse tempo reduzido para obtenção de resultados tem sido usado por médicos para acelerar tratamentos personalizados com base nos dados da biópsia . Em 2016, um estudo prospectivo utilizando ddPCR no Dana-Farber Cancer Institute autenticou o benefício clínico da biópsia líquida como ferramenta diagnóstica preditiva para doentes com cancro de pulmão de células não-pequenas . A aplicação de testes de biópsia líquida também foi estudada em doentes com cancro da mama, colorretal, ginecológico, e bexiga para monitorizar tanto a carga da doença quanto a resposta do tumor ao tratamento.

Expressão génica e quantificação de RNA Estudos de expressão génica e quantificação de RNA têm beneficiado do aumento da precisão e da quantificação absoluta do ddPCR. A quantificação de RNA pode ser realizada via RT-PCR, na qual o RNA é retrotranscrito em cDNA na própria reação particionada, e o número de moléculas de RNA originadas de cada transcrito (ou transcrito alélico) é quantificado via ddPCR. É frequentemente possível obter maior sensibilidade e precisão usando ddPCR em vez de qPCR para quantificar moléculas de RNA, em parte porque não requer o uso de uma curva padrão para quantificação. O ddPCR também é mais resistente a inibidores de PCR para a quantificação de RNA do que o qPCR. O ddPCR pode detectar e quantificar mais espécies-alvo individuais por canal de detecção do que o qPCR, em virtude de ser capaz de distinguir alvos com base na sua amplitude de fluorescência diferencial ou pelo uso de combinações de cores distintas para sua detecção. Como exemplo disso, um sistema ddPCR de 2 canais foi usado para detectar num único poço a expressão de quatro variantes de splicing diferentes da transcriptase reversa da telomerase humana, uma proteína que é mais ativa na maioria das células tumorais do que em células saudáveis.

Usos alternativos para particionamento Utilizando as capacidades de particionamento dinâmico empregadas no ddPCR, o sequenciamento NGS aprimorado pode ser alcançado através do particionamento de reações de PCR complexas antes da amplificação, resultando numa amplificação mais uniforme em diversos amplicons distintos para análise NGS . Além disso, a especificidade aprimorada de reações de amplificação de PCR complexas em gotículas demonstrou reduzir significativamente o número de iterações necessárias para selecionar aptâmeros de alta afinidade no método SELEX . O particionamento também permite medições mais robustas da atividade da telomerase a partir de lisados celulares. As capacidades de particionamento dinâmico do ddPCR também podem ser utilizadas para particionar milhares de núcleos ou células inteiras em gotículas individuais, facilitando a preparação de bibliotecas para um ensaio de célula única para cromatina acessível à transposase utilizando sequenciamento (scATAC-seq).

História O PCR digital surgiu de uma abordagem publicada pela primeira vez em 1988 pela Cetus Corporation, quando investigadores demonstraram que uma única cópia do gene da β-globina poderia ser detectada e amplificada por PCR. Isso foi alcançado diluindo amostras de DNA de uma linhagem celular humana normal com DNA de uma linhagem mutante com deleção homozigótica do gene da β-globina, até que este não estivesse mais presente na reação. Em 1989, Peter Simmonds, AJ Brown et al. utilizaram esse conceito para quantificar uma molécula pela primeira vez. Alex Morley e Pamela Sykes estabeleceram formalmente o método como uma técnica quantitativa em 1992. Em 1999, Bert Vogelstein e Kenneth Kinzler cunharam o termo "PCR digital" e demonstraram que a técnica poderia ser usada para encontrar mutações raras em cancro. No entanto, o PCR digital era difícil de realizar; era trabalhoso, exigia muito treino para ser feito corretamente e era difícil de ser feito em grandes quantidades. Em 2003, Kinzler e Vogelstein continuaram a refinar o PCR digital e criaram um método aprimorado que chamaram de tecnologia BEAMing, um acrónimo para "beads, emulsion, amplification and magnetics" (esferas, emulsão, amplificação e magnetismo). O novo protocolo usava emulsão para compartimentalizar as reações de amplificação num único tubo. Essa mudança possibilitou aos investigadores escalar o método para milhares de reações numa única execução. Em 2007 , Mikael Kubista, Stephen Bustin e colaboradores publicaram o primeiro estudo de dPCR usando a primeira plataforma de nanolitros, com um número maior de partições, desenvolvida pela Fluidigm, estudando a distribuição intracelular de mRNA. Empresas que desenvolvem sistemas comerciais de dPCR integraram tecnologias como a separação automatizada de amostras, a contagem digital de alvos de ácidos nucleicos e o aumento da contagem de gotículas, o que pode ajudar a tornar o processo mais eficiente. Nos últimos anos, investigadores desenvolveram e comercializaram diagnósticos baseados em dPCR para diversas doenças, incluindo cancro de pulmão de células não-pequenas e síndrome de Down . O primeiro sistema de dPCR para uso clínico recebeu a marcação CE em 2017 e foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA em 2019, para o diagnóstico de leucemia mieloide crónica .

Referências